表观遗传不佳

第2部分:天齐网首页表观遗传的准则

阿尔玛·兰尼(Alma Laney)和艾莉森·伯恩斯坦(Alison Bernstein)

这是第二篇文章 系列 关于跨世代的遗传,表观遗传学和草甘膦解决了论文发表所提出的问题, 草甘膦诱导的表观遗传的世代遗传的病理学和精子突变的评估:世代毒理学.

天齐网首页表观遗传的准则

2017年的一篇论文提到,“设计哺乳动物种系依赖性表观遗传遗传实验的指南”,为正确设计种系表观遗传遗传天齐网首页提供指导,以控制我们在上一节中提到的变量。我们将在此处总结要点,并将建议与正在讨论的天齐网首页设计进行比较。

动物株

先前的天齐网首页(包括来自发表此草甘膦论文的实验室的天齐网首页)表明,动物的近交品系对有毒物质暴露和饮食的跨代影响更为敏感,不同的小鼠品系对这些影响的敏感性不同。近交小鼠比近交小鼠更类似于人类。但是,由于每只小鼠的基因都不相同,因此对近交品系的实验变得很难解释,从而破坏了从遗传效应中分离出跨代表观遗传效应的目的。 表观遗传实验指南 指出:“除非有明确的理由选择自交系,否则我们建议使用自交系以消除遗传变异并帮助表观遗传数据的解释。”

草甘膦纸使用的是近交系,这为其结果提供了巨大的混淆效果。他们在3代育种后鉴定出的遗传差异根本无法解释。实际上,他们自己的数据表明,遗传学起着巨大的作用(请参见创建者的作用一节),而这一点没有得到适当的解决。

为跨代天齐网首页选择近交品系会产生许多问题,难以解释结果。但是,在有关本文的Sprague Dawley大鼠的具体选择的在线讨论中,已经有很多报道,因此值得探讨是否值得关注。这些大鼠容易发生自发性肿瘤,大多数肿瘤发生在一岁后。 1992年 探索了Sprague Dawley大鼠自发性肿瘤病变的发生率,这些大鼠在1986-1992年的17项慢性毒性/致癌性天齐网首页中用作对照。在1340只雄性和1329只雌性大鼠中,到2岁时,约有15%的雄性大鼠和〜22%的雌性大鼠因存在肿瘤而死亡或被处死,直到15个月大时才出现。该论文还描述了这些动物的非癌性健康问题。

这些与年龄相关的自发性肿瘤在任何老鼠衰老的天齐网首页中都特别引起关注。但是,在这项天齐网首页中,对动物实施安乐死的时间为12个月,因此这不是主要问题,但是应跟踪肿瘤的发生率,位置和类型。对照动物将是基线比较,以寻找癌症发病率基础率增加的情况。

在目前的论文中,尽管似乎进行了深入的病理学分析,但他们将所有“疾病”归为一类。例如,在睾丸中,他们天齐网首页了癌症和不育的标志物,但将它们都归类为疾病/无疾病的二元分类。在其他组织中,既可以识别与癌症相关的病理,也可以将与非癌症相关的病理归纳为同一二进制分类方案。将如此深入的病理分析简化为二元疾病/无疾病变量似乎很奇怪。这样做会使统计数据产生偏差,有利于获得具有统计意义的结果。上面引用的1992年论文描述了老年Sprague Dawley大鼠的自发肿瘤,这为作者如何通过组织分离出各种类型的癌症提供了对比。将所有这些都集中在一起的选择使得难以解释这些结果,尤其是考虑到应变的选择。

母系与父系育种

由于这些天齐网首页涉及多代动物,因此精心设计的育种方案至关重要,而在手稿中报告这些育种方案也同样重要。由于环境引起的变化可以继承自母亲,父亲或父母双方,因此在实验中控制这些变化很重要。

For this reason, the authors of the review recommend not using a 双重繁殖组 in which exposed males and exposed females are bred together.

评估这些选择的育种设计需要将父代的雌性和雄性暴露于天齐网首页环境因素(例如实验饮食和对照饮食),然后繁殖暴露的雌性以控制幼稚的雄性(母体)和暴露的雄性以控制幼稚的雌性。 (父系)。一个‘dual breeding group’其中也可以包括暴露的雄性与暴露的雌性一起育种,以测试可能的相互作用效应,该效应可能不同于仅通过一个亲本的传播所产生的效应,但是双重育种应始终辅以母系和/或父系育种。

这不是草甘膦纸中所做的。雄性和雌性在没有互补的母系或父系繁殖的每一代中都被暴露和杂交。作者在结果部分解释了育种策略。

为了避免在对照或草甘膦谱系中出现任何近交伪像,未使用同胞或堂兄弟种育种(杂交)。通常,如前所述,饲养来自不同窝的6–8位创始妊娠雌性,每个窝的5种不同性别的动物用于为每一代生成25–50个性别的个体进行分析。

这表明在所有世代都只采用了双重育种策略,因此血统现在相互交织而不是独立的(这对于以后的统计学讨论很重要)。尽管这种近交确实抵消了使用上文讨论的近交菌株的影响,但确实引起了一系列不同的关注。

对于像这样的多代天齐网首页,很难设计出一种育种策略来保持它们完全独立,而无需产生大量动物。因此,仔细的报告和适当的分析变得更加关键。这个 一项报告完备的天齐网首页的结果使读者能够理解并追溯到原始世代,解释这是母系的,并详细说明了他们如何在每一代中选择配对。

交配期间同居的持续时间

如上所述,性状的跨代遗传可以通过 表观遗传,生态或文化机制。在母系实验中,设计实验以允许将种系效应与已知会对子代产生终身影响的产前或产后变量区分开来至关重要。由于雄性啮齿动物可以在交配后与雌性分开,因此许多天齐网首页人员选择了父系育种方案。但是,如果治疗改变了雄性的健康,外观或行为,则可能会影响雌性在交配过程中,并以与种系传播无关的方式引起后代的变化。

有多种方法可以解决此问题,在上述指南中详细讨论了每种实验设计选择的注意事项。但是,即使选择这些提议的方法中的一种来控制这些效果,男性在同居期间仍然有可能影响女性。因此,绝对排除这些其他影响的唯一方法是使用辅助生殖技术,该主题也在指南中进行了讨论。草甘膦纸未提供有关交配期间同居持续时间的信息。

团体人数

实验设计中最重要的步骤之一是确定组大小以进行统计分析。通常在实验开始之前根据预期效果的大小,基于先导天齐网首页或已发布数据的预期效果的可变性以及数据的预期分布来估计组的大小。然后,天齐网首页人员向后工作以在父母代中给适当数量的动物配药。本文没有指出父母代中有多少雄性和雌性动物。另外,对照组和草甘膦之间的群体大小各不相同,世代相传,但没有任何理由说明为什么设置这些大小以及为什么它们如此不同。

一个相关的考虑因素是提前确定将要进行的统计检验,以确保所选的组大小足以检测差异。样本量规划不足可能会在天齐网首页开始前就注定要失败,从而造成伦理和资源问题。样本数量太小会错过真实的关联,而会发现不存在的关联。这将是一个道德问题,因为无法解决当前问题的实验是浪费动物,并且与动物天齐网首页的3个标准(替代,还原和精炼)不一致。这也是浪费时间和资源。太大的样本量也是出于伦理道德的考虑,因为不必要地使用了动物,这些动物不需要回答眼前的问题,也不需要使用不必要的资源。

选择要繁殖的动物

这是方法中经常未提及的关键点,本天齐网首页也不例外。在几乎每个实验中,从每一窝的每一代,都观察到一系列表型。因此,天齐网首页人员面临着从每个窝中选择哪种动物进行各种分析和繁殖下一代的选择。有多个选项。如果可以在牺牲前进行测试,则可以在繁殖前对动物进行测试以帮助选择育种者,可以在繁殖后对动物进行测试,或者可以将不同的动物用于分析和繁殖。处死后进行的测试可以在繁殖后进行,以获取有关有助于谱系的动物的数据,也可以将单独的动物用于分析和繁殖。另一种可能性是将动物随机分配用于繁殖和其他终点。这些方案中的每一个都有优点和缺点。这些问题将在 指南.

从方法上尚不清楚作者如何选择动物进行行为测试,验尸分析,精子收集和进一步繁殖。通过选择封闭群引入的附加变化和奠基者效应,使这里适当的选择更大的需求。再次,由于方法缺乏细节,加上选择使用近交系和观察到的建立者效应,使得很难解释所报告的结果。至少需要报告这些决定。

避免乱扔垃圾和笼子

一个众所周知的现象是,与来自不同笼子或垃圾的动物相比,来自同一个笼子或垃圾的动物在行为和分子测量上更为相似。必须对断奶策略进行精心设计的天齐网首页,并且必须报告这些选择。断奶是指幼崽与母亲分开,按性别分开并分配到新的笼子里。断奶时要做出的主要决定是将同一个同窝的同性兄弟姐妹放在一起,还是与其他同窝的同性动物交叉饲养。

预防乱丢垃圾的指南中的一项重要建议是,保持实验组内和实验组之间每个笼子的动物数量恒定或至少在一个狭窄的范围内,特别是对于行为测试,其中已知每个笼子的动物数量会产生影响行为。有多种策略可用(例如,指南中概述的剔除或交叉培育),天齐网首页人员必须选择如何设计实验以最好地控制这些问题。如果不可能从独立的垫料中选择动物,则必须在统计模型中包括垫料。

与讨论的许多其他实验设计选项一样,每种选择都有其优点和缺点。这强调了在方法部分中报告断奶策略的必要性。妊娠期幼崽数量对多种表型的影响也是已知的。一些天齐网首页通过仅在后续阶段使用给定大小的垫料来解决此问题。草甘膦纸未提供有关断奶策略或垫料尺寸的信息。

定义实验单位

这与避免乱扔垃圾和笼子影响,确定群体规模并选择适当的统计测试有关。如指南中所述,实验单位是实验中分配给组的实体,是统计分析的单位。对于父系育种方案,每只雄性小鼠都是实验单位。对于母系育种方案,暴露的雌性小鼠是实验单位。从技术上讲,所有来自幼仔的幼崽都是同一实验单元的一部分,被视为一个样本。

这也突出了我们前面讨论的双重育种方案的一些实验设计问题。乱伙伴不能视为独立措施。未能适当地认为母亲是实验单位,而使用单独的幼崽作为实验单位会导致虚假阳性率升高(I型错误)。这适用于每一代,这在很大程度上推动了对非常大量的动物进行跨代天齐网首页的需求。跨代方法指南的作者建议以下内容:

这个问题需要在实验计划期间通过使用功率分析来估计实验所需的垫料数量,并将每一代垫料的数量作为实验单位进行计算来解决。然后,可以将不同窝的动物分配给不同的行为或分子测试,以进行繁殖。或者,可以测试来自同一窝的多只动物,但应该对它们的分数取平均值并视为一个样本,或者天齐网首页人员可以采用混合效应分析模型,以确保动物被窝在窝中。

在草甘膦纸的方法中,关于这些问题的信息很少。没有提供有关同窝伴侣的信息。每组使用的动物数量不一致,表明其中一些动物实际上是同窝出生的。依靠报道的数字和补编中提供的数据引起了人们对天齐网首页人员是否正确定义实验单位,适当计划的小组规模或受垫料和笼养影响控制的重大关注。

总之,所描述的天齐网首页设计不足以回答草甘膦暴露是否在F3代中诱导跨代表观遗传的问题。为了使作者有疑问,这可能是报告问题,天齐网首页设计可能足够。甚至回到本实验室以前的论文中,天齐网首页与其他有毒物质一起进行的跨代表观遗传遗传,也没有在许多这些问题上增加清晰度。这些天齐网首页中有许多遭受某些或所有这些相同问题的困扰。

该实验室已经开发了他们的系统,并正在使用他们的系统来测试各种不同的化合物。如果所使用的方法合适并且该系统已被证明可以解决当前的问题,则这种“即插即用”方法并不一定有什么问题。考虑到此处和其他论文中可能存在的方法学问题,这种“即插即用”方法在这里似乎不合适。他们似乎多年来一直在使用相同的设计,而没有严格评估该设计是否随着领域的学习和进步而起作用。

科学论文的目的是向读者提供足够的信息,以理解和解释结果。由于方法学报道不佳,本文撰写时提出了很多问题,以致于本天齐网首页的结果在很大程度上无法解释。即使数据收集或统计数据没有问题,但由于方法问题,从提供的信息中得出任何结论也将极为困难。如所报道的,该方法不足以确定跨代表观遗传是否正在发生。

鉴于这些实验性设计问题,我们有可能在不进行详细介绍的情况下将其丢弃。但是,即使我们认为所有这些方法问题都可以通过不良报告来解释,并且天齐网首页设计实际上是可以的,但探索进一步使报告结果复杂化和混淆的其他问题也是有用的练习。


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